水稻苗中苯丙氨酸解氨酶（PAL）的应用方案

引言

苯丙氨酸解氨酶（PAD 对植物体的木质素、植保素、类黄酮、花青素等次生物质的形成起重要的调节作用，且与植物的抗病作用有一定的关系。本实验了解测定苯丙氨酸解氨酶活性的原理和方法。

关键词

苯丙氨酸解氨酶、美析紫外

原理

苯丙氨酸解氨酶是植物次生代谢中的一个关键酶。它催化 L-苯丙氨酸的脱氨反应. 释放氨而形成反式肉桂酸。根据产物反式肉桂酸在波长 290 nm 处吸光度的变化，可以测定该酶的活性。

材料与仪器

UV-1800紫外可见分光光度计、冷冻高速离心机，旋涡混合器，恒温水浴锅等

材料：黄化水稻幼苗

试剂：0. 1 mol / L硼酸缓冲液（pH 8. 8）；0. 02 mol/ L 1 L-苯丙氨酸：称取3.33 g/ L-苯丙氨酸溶于1000 mL 0. 1 mol/L"1 硼酸缓冲液（pH 8. 8）；7 mmol - 統基乙醇硼酸 缓冲液：0. 11 mL 藐基乙醇用 0. 1 mol/L-1 硼酸缓冲液溶解，并定容至 200 mL；聚乙烯毗咯 烷酮（PVP）。

实验步骤

酶液制备：称取黄化水稻幼苗 0.5 g, 先加 1.5 mL 预冷的提取液（即 7 mmol - L-1 蔬 基乙醇硼酸缓冲液）、过量的聚乙烯毗咯烷酮（PVPX 但不能太多，否则不易研磨）、少量石英 砂在冰浴下研磨成浆，再加 3.5 mL 预冷的提取液使其终体积为 5 mL。于 12 000 g 4°C 下离心15 min, 用吸管吸取上清液，即粗酶液。

酶活测定：

反应液包括：①0.02 mol - L_1 L-苯丙氨酸 1 mL；

②0.1 mol - L 1 硼酸缓冲液（pH 8. 8）2 mL；

③0.1 mL 粗酶液。

（对照以 0. 1 mL 疏基乙醇缓冲液代替酶液）

反应液用涡旋混合器混匀后立即在 290 nm 处测起始吸光度值，并精que计时。（每一样品 重复两组）将测定后的各管于 30 °C 水浴保温 30 min, 再于 290 nm 处测定各管的吸光度值。 本实验用UV-1800紫外可见分光光度计以每 30 min 在波长 290 nm 处吸光度值增加 0. 01 所需酶量为 1 个单位（U）。

苯丙氨酸解氨酶活性（U - g^-1鲜重）=

式中a 一测定时的酶液用量，mL；

V—酶液总体积，mL；

W—样品重，g。

（苯丙氨酸解氨酶活性也可以 U • mg^-1 蛋白表示. 蛋白质含量可用考马斯亮蓝 G-250 法测定，以牛血清白蛋白作标准）。

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