摘要：牛奶营养成分很高，富含蛋白质和微量元素钙、铁、锌等，是人们生活中的主要要营养食品。因此，分析牛奶中的营养成分含量是很有必要的工作。本实验在普通实验室条件，采用简单科学快捷的方法分析某品牌牛奶中部分成分含量。

用分光光度法测某牛奶中蛋白质、钙、铁、锌的含量。

牛乳中的主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯酪蛋白。

双缩脲(NH₂CONHCONH₂)在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，称为双缩脲反应，蛋白质分子中含有许多肽键在碱性溶液中也能与Cu²⁺反应产生紫红色化合物。在一定范围内，其颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。因此，可以利用比色法测定蛋白质浓度。双缩脲法是测定蛋白质浓度的常用方法。操作简便、迅速、受蛋白质种类性质的影响较小，但灵敏度较差，而且特异性不高。除-CONH-有此反应外，-CONH₂、-CH₂NH₂、-CS-NH₂等基团也有此反应。

钙与身体健康息息相关，钙除成骨以支撑身体外，还参与人体的代谢活动，它是细胞的主要阳离子，还是人体*活跃的元素，缺钙可导致儿童佝偻病，青少年发育迟缓，孕妇高血压，老年人的骨质疏松症。缺钙还可引起神经病，糖尿病，外伤流血不止等多种过敏性疾病。补钙越来越被人们所重视。牛奶中含有易被人体吸收得钙，有些牛奶产品中还特地加钙而成为钙奶。对于液体牛奶中钙的含量，可采用EDTA法进行直接测定。考虑到牛奶中含有Fe³⁺、Al³⁺等干扰离子，可以加入少量三乙醇胺以消除它们的，调节pH≈12～13，以铬蓝黑R作指示剂，指示剂与钙生成红色的络合物，当用EDTA滴定至计量点时，游离出指示剂，溶液呈现蓝色。

 

当一束光通过一个吸光物质（通常为溶液）时，溶质吸收了光能，光的强度减弱。吸光度就是用来衡量光被吸收程度的一个物理量。

　　吸光度用A表示。

　　A＝abc，其中a为吸光系数，单位L/(g·cm),b为液层厚度（通常为比色皿的厚度），单位cm ， c为溶液浓度，单位g/L

　　影响吸光度的因数是b和c。a是与溶质有关的一个常量。此外，温度通过影响c，而影响A。

　　符号A，表示物质对光的吸收程度。

邻二氮菲也叫邻菲啰啉，是测定微量Fe²⁺的高灵敏度显色剂在pH 2～9的条件下，Fe²⁺与邻二氮菲生成稳定的橙红色络合物，在510nm波长处有吸收。

 

该配合物的 lgk_稳 ＝ 21.3（20 ℃），摩尔吸光系数 ₅₁₀ =1.1×10⁴L·mol^-1·cm^-1 。 在显色前，首先用盐酸羟胺把 Fe³⁺ 离子还原为 Fe²⁺，其反应式如下：

2Fe³⁺+2NH₂OH·HCl ＝ 2Fe²⁺+4H⁺ +2Cl^- +N₂↑ +2H₂O

测定时，控制溶液的酸度在 pH＝5 左右较为适宜。酸度高时，反应进行较慢；酸度太低，则 Fe²⁺离子水解，影响显色。当铁浓度在5.0 mg／mL以内时，吸光度与Fe²⁺浓度呈直线关系。Bi³⁺、Cd³⁺、Hg⁹⁺、Ag⁺、Zn²⁺等离子在 pH ＝ 2~9 时与邻二氮菲生成沉淀。 Co²⁺， Ni²⁺， Cu²⁺等离子可与邻二氮菲形成有色配合物，故应注意它们的干扰。

锌是人体中必需的微量元素，锌缺乏会阻碍生长发育，过量又会导致胃癌等疾病。人类从牛奶等饮食中可以获得一定量的锌。在pH4.0～5.5的水溶液中，锌离子与双硫腙（C₁₃H₁₂N₄S）生成红色螯合物，摩尔吸光系数 ₅₃₅ =9.3×10⁴L·mol^-1·cm^-1用四氯化碳萃取后比色定量。在选定的pH条件下，用足够量的硫代硫酸钠可掩蔽水中存在的少量铅、铜、镉、钴、铋、镍、金、钯、银、亚锡等干扰金属离子。

 

 3.1、试剂的配制、仪器准备

3.11、pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液的配制:

先配A液与B液。A液：0.2mol/L醋酸钠溶液。B液：0.2mol/L醋酸溶液。

取醋酸钠固体6.5461g加水溶解并稀释至100ml，取冰醋酸5mL加水稀释至100ml，混合即得pH4.7的醋酸——醋酸钠缓冲液200mL。

3.12、乙醇—混合液的配制：取25ml95％乙醇与25ml无水混合

3.13、双缩脲试剂：称取CuS0₄·5H₂O 0.3g，酒石酸钾0.9 g和碘化钾0.5g，分别溶解后混匀，加6 mol·L^-1NaOH 10mL，*后加水至100mL，贮于棕色瓶中，避光，可长期保存。

3.14、蛋白质标准液(10mg·mL^-1)，用小烧杯称取干燥的牛血清蛋白100.0mg，以少量生理盐水溶解后倒入l0mL容量瓶中，淋洗小烧杯数次，一并倒入容量瓶中，*后加生理盐水至刻度线。待测蛋白样本：将牛奶样品用生理盐水准确配制成一定浓度的溶液后再测定；将制得的酪蛋白用生理盐水准确配制成一定浓度的溶液后再测定。（如若不能溶解，滴加几滴6mol/L NaOH溶液、分别用l0mL容量瓶定容）

3.15、铁标准溶液(40.0µg·mL^-1)：:准确称取0.0345g硫酸铁铵〔 NH₄ Fe (SO₄)₂·12H₂O〕于烧杯加入6mL6 mol·L^-1 HCl 和少量水，溶解后用纯水定容至10mL。此溶液1.00mL含有40.0µg铁。

3.16、盐酸羟胺溶液(100 g·L^-1)：:称取10g盐酸羟胺(NH₂OH·HCl)，溶于水，并稀释至100m（新鲜配制，两周内有效）

3.17、邻二氮菲溶液(2g·L^-1):：称取0.20g邻二氮菲(C₁₂H₈N₂·H₂O)，溶解于加有2滴浓盐酸的纯水，并稀释至100mL（新鲜配制，两周内有效）

3.18、醋酸钠溶液（1.0 mol·L^-1）：:称取8.2030g醋酸钠，用纯水溶解后稀释至100mL。

3.19、锌标准溶液（1.00µg·mL^-1）：准确称取0.0100g基准锌于100mL烧杯中，加入6 mol·L^-1HCl 0.5mL，立即盖上表面皿，待锌完全溶解后，以少量水冲洗表面皿及烧杯壁，将溶液转入100mL容量瓶中，定容，即为锌标准贮备溶液。准确移取1mL锌标准贮备溶液，稀释定容至100.0mL，即得1.00µg·mL^-1锌标准溶液。

3.20、0.1％双硫酸腙四氯化碳贮备溶液：称取0.10g双硫腙（C₁₈H₁₂N₄S），在干燥的烧杯中用四氯化碳溶解后稀释至100 mL， 倒入棕色瓶中。此溶液置冰箱内保存，可稳定数周。

3.21、双硫腙四氯化碳溶液：临用前，吸取适量双硫腙四氯化碳贮备溶液，用四氯化碳稀释约30倍，至吸光度为0.4（波长535 nm，1cm比色皿）。

3.22、25％硫代硫酸钠溶液：称取64.60g硫代硫酸钠（Na₂S₂0₃·5H₂0)，溶于100mL纯水中。

3.23、1＋1 氨水溶液:10ml氨水加10ml水稀释

3.24、V-1300型可见分光光度计

3.21、酪蛋白的粗提

    50mL鲜牛奶加热至40℃。在搅拌下慢慢加入预热至40℃、pH4.7的醋酸缓冲液50mL.用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。

将上述悬浮液冷却至室温。离心15分钟（3000 r ·min^-1）。弃去清液，得酪蛋白粗制品。

3.22、酪蛋白的纯化

用水洗涤沉淀3次，离心10分钟（3000r·min^-1），弃去上清液。在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇—混合液洗沉淀2次。*后用洗沉淀2次，抽干。将沉淀摊开在表面皿上，风干；得酪蛋白纯品。

3.31、标准曲线的绘制与样品的测定

取试管8支，按下表操作。

各管混匀、放置37℃水浴中保温20min。540nm比色，以空白管调零点，读取各管吸光度值。

3.32、计算

在电脑上以吸光度值为纵坐标，以蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。从标准曲线中查出待测样本的蛋白质浓度(g／L)，并求出牛奶中蛋白质浓度。由此浓度计算出100mL鲜牛奶中酪蛋白的真实含量。

3.41、钙制剂钙含量的测定

准确移取25ml的鲜牛奶和钙奶，分别转移到100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。

准确移取上述试液20.00mL，加入三乙醇胺溶液5mL，5mol·L^-1NaOH 4mL，加入水20mL，摇匀，加铬蓝黑R8~10滴，用0.01mol·L^-1EDTA标准溶液滴定，接近终点时再补加2～3滴铬蓝黑，当溶液由红色变为蓝色即为终点，根据消耗EDTA的体积，计算出鲜奶和钙奶中钙的含量（g/100 mL），并与包装上注明的含量作比较。

3.42、注意事项

量取鲜奶和钙奶的量视钙含量多少而确定，以消耗0.01 mol·L^-1EDTA体积为20~30 mL。牛奶、由于钙奶均为乳白色，终点颜色变化不太明显，接近终点时再补加2～3滴指示剂。

3.51、标准曲线的绘制

取25mL比色管6支，按下表顺序配制铁标准系列并记录测量的数据（注意：加入盐酸 钱干后需摇匀放置2 min，再进行下一步操作），加完试剂后摇匀，放置37℃水浴中保温15min，以空白液为参比，在510nm下测定各溶液的吸光度值。

取25mL比色管2支，按照上表及上述方法测定510 nm下的吸光度值。

3.52、计算

     在电脑上以吸光度值为纵坐标，以铁质量浓度（µg·mL）浓度为横坐标绘制标准曲线。

利用标准曲线计算鲜奶中铁的含量（mg/100mL）。

3.53、样品的测定

将50ml鲜奶一滴一滴加到热坩埚中避免沸腾蒸发。除去水份后, 强烈加热至450~550℃ 1小时。冷却后, 加1 mL浓硝酸蒸发近干, 重新在450~550℃灼烧（不能溅出）。用少量稀硝酸溶解白色残液, 转入10mL容量瓶中稀释至刻度, 用稀氢氧化钠溶液调pH=7~8。

3.61、标准曲线的绘制与样品的测定

   将70ml鲜奶一滴一滴加到热坩埚中避免沸腾蒸发。除去水份后, 强烈加热至450~550℃ 1小时。冷却后, 加1 mL浓硝酸蒸发近干, 重新在450~550℃灼烧（不能溅出）。用少量稀硝酸溶解白色残液, 转入10mL容量瓶中稀释至刻度, 用稀氢氧化钠溶液调pH=7~8。再用蒸馏水稀释到25ml.

可准确吸取1ml水样，用纯水稀释至10.0mL。

另取分液漏斗8个，依次加入锌标准溶液0、0.50、1.00、1.50、2.00、3.00、4.00和5.00mL，各加纯水至10mL。

向水样与标准系列分液漏斗中各加1滴甲基红指示剂，用1＋1氨水调节溶液刚显黄色，再滴加乙酸溶液至红色（pH约4.4）。加5mL四氯化碳，振摇萃取甲基红，弃去有机相。

向各分液漏斗中加入5.0mL缓冲溶液混匀，再加入1.0mL硫代硫酸钠溶液，混匀，再加入10.0mL双硫腙四氯化碳溶液，强烈振荡4min，静置分层。

用脱脂棉或卷细的滤纸擦去分液漏斗颈内的水，弃去*初放出的2～3mL有机相，收集随后流出的有机相于干燥的10mL比色管内。于535nm波长下，用1cm比色皿，以四氯化碳为参比，测定样品和标准系列溶液的吸光度。绘制校准曲线，在曲线上查出样品管中锌的含量。

注：①本法测锌要特别注意防止外界污染，同时还要避免在直射阳光下操作。

②加入硫代硫酸钠除了掩蔽干扰金属离子的作用外，同时也兼有还原剂的作用，保护双硫腙不被氧化。由于硫代硫酸钠也能与锌离子络合，因此标准系列中硫代硫酸钠的加入量应与样品管一祥。

③振荡时间必须充分，因硫代硫酸钠是较强的络合剂，只有使锌从络合物 Zn(S₂O₃)^2-中释放出来，才能被双硫腙四氯化碳溶液萃取。而锌的释放又比较缓慢，因此振荡时间要保证4min，否则萃取不完全。为了使样品和标准的萃取率一致，应尽量做到振摇强度、次数一致。

 

4.1牛奶中酪蛋白的提取、

酪蛋白含量:6.1354g/100ml

得率=

4.2酪蛋白含量的测定

4.21、标准曲线的绘制与样品的测定

4.22、计算

在电脑上以吸光度值为纵坐标，以蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。从标准曲线中查出待测样本的蛋白质浓度(g／L)，并求出牛奶中蛋白质浓度。由此浓度计算出100mL鲜牛奶中酪蛋白的真实含量。

 

 

故拟合所得y=-0.0029+0.25357x,相关系数r=0.99988

 

4.3钙含量的测定

4.31、钙制剂钙含量的测定

 

100ml鲜奶含钙量：

鲜奶包装上含钙量为100ml鲜奶含0.102g~0.107g钙与测量结果基本相符

100ml高钙奶含钙量：

而高钙奶包装注明含钙量为100ml高钙奶含0.130g~0.140g钙远远高于测量结果，说明高钙奶含钙量名不符实。

4.4铁含量的测定

4.41、标准曲线的绘制

 

 

故拟合所得y=0.01229+0.22036x,相关系数r=0.99773

当吸光度y=0.077时，铁溶液浓度x=0.294

当吸光度y=0.057时，铁溶液浓度x=0.249

故其平均值为0.249

每100ml鲜奶中铁含量为0.249 =0.125mg

4.5锌含量的测定

4.51、标准曲线的绘制与样品的测定

 

 

 

 

 

 

 

故拟合所得线性方程为y=0.12306+0.67912x,相关系数r=0.99292

且当吸光度y=0.368时，待测样浓度x=0.361

故每100ml鲜牛奶含锌量为0.361

  5.3钙含量测定

      鲜奶包装上含钙量为100ml鲜奶含0.102g~0.107g钙与测量结果0.107基本相符

而高钙奶包装注明含钙量为100ml高钙奶含0.130g~0.140g钙远远高于测量结果 ，虽然滴定到终点时颜色变化比较不明显，消耗的EDTA的量有一定误差，但即使是这样求出的含钙量也不会这么低，所以说高钙含钙量没有如包装上所说那么多。实验注意事项考虑到牛奶中含有Fe³⁺、Al³⁺等干扰离子，可以加入少量三乙醇胺以消除它们的，调节pH≈12～13，以铬蓝黑R作指示剂，指示剂与钙生成红色的络合物，当用EDTA滴定至计量点时，游离出指示剂，溶液呈现蓝色。

5.4 铁含量的测定

   实验所测铁含量为0.125mg/100ml远远低于包装上所说0.3mg/100ml,原因可能由于牛奶灼烧不够充分，导致部分残液不溶，致使所得样品偏少，但也有可能是本身牛奶液中含铁量与包装上不符实。本实验应注意的事项牛奶的灼烧，需一滴一滴的加，防止沸腾蒸发，而且溶液的酸度要控制在7到8之间为宜，酸度太高，反应进行较慢，酸度太低，则二价铁离子水解，影响显色。

5.5 锌含量的测定

   实验所测锌含量为0.123mg/ml远远低于包装上所说的0.40mg/100ml，可能由于该方法测锌对实验条件要求较高，要避免外界污染，同时要避免光直照，而且在萃取锌的时候要求振摇强度，次数一致，而实际过程中是很难做到的。故绘出的标准曲线有一定误差。